2-2-5: علل ايجاد سرطان پستان 14
2-2-6: علائم سرطان پستان 16
2-2-7: تشخيص سرطان پستان 17
2-2-8: رده بندي سرطان پستان 19
2-2-9: درمان سرطان پستان 21
2-2-10: سرطان عود كننده پستان 24
2-2-11: سرطان پستان در مردان 24
2-3: ژنتيک سرطان 25
2-3-1:سرطان 25
2-3-2: انکوژن‌ها 26
2-3-3: ژنهاي سرکوب کننده تومور 29
2-3-4: اختلالات تنظيم چرخهي سلولي در سرطان 29
2-3-5: P53 محافظ ژنوم 31
2-3-6: نقش BRCA1/2 31
2-3-7: نقص در ماشين ترميم 32
2-3-8: توانايي تحريک رگزايي و متاستاز تومورهاي بدخيم 32
2-3-9: بررسي ماركرها در خون افراد مبتلا به سرطان پستان 32
2-4: آنتي ژنهاي سرطاني- بيضه ايي 33
2-4-1: کلاسه بندي ژنهاي سرطاني-بيضه اي 34
2-4-2:تنظيم بيان آنتي ژنهاي سرطاني – بيضه ايي 35
2-4-3: عملکرد ژنهاي سرطاني-بيضه اي 35
2-4-4: ايمونوژنيسيته آنتي ژنهاي سرطاني- بيضه ايي 35
2-4-5: ژنهاي مورد بررسي: ARMC3, TPTE, TTK 36
2-5: مباني تئوريك در Real-Time PCR 38
2-5-1. کنترل داخلي : 39
فصل سوم: مواد و روش ها 41
3-1: نمونه گيري 42
3-1-1 .روش جمع آوري و تعداد نمونه ها 42
3-2.استخراج RNA از نمونه بافتهاي جمع آوري شده 43
3-2-1 . محلول هاي مورد نياز 43
3-2-2. روش استخراج RNA از بافت 43
3-2-3 .روش الکتروفورز کردن نمونه RNAبر روي ژل آگارز 8/0 درصد 45
3-2-4. ظهور باندهاي RNAبر روي ژل 45
3-3. تيمار RNA جهت حذف DNA ژنومي 45
3-4 .سنتز cDNA از RNA استخراج شده از بافت 46
3-5. طراحي پرايمر و پروب و بررسي کيفيت آنها : 46
3-5-1. غلظت بهينه پرايمر 47
3-5-2. آناليز منحني ذوب: 48
3-5-3. غلظت بهينه پروب: 48
3-5-4. تهيه سريال رقت به منظور بررسي كارائي پرايمرها : 48
3-6-. انجام تکنيک Real-Time PCR بر روي نمونه هاي مورد مطالعه : 48
3-6-1. تجزيه و تحليل نتايج بدست آمده از Real-Time PCR: 50
3-7. نحوه تجزيه و تحليل داده ها: 51
فصل چهارم: نتايج و يافته ها 52
4-1. اطلاعات دموگرافيک جمعيت مورد مطالعه 53
4-2 :آناليز RNA 54
4-2-1 :آناليز کمي RNA 54
4-2-2 :آناليز کيفي RNA 54
4-3. آناليز کمي RNA تيمار شده 55
4-4. بهينه سازي پرايمرها 56
4-4-1. آناليز منحني ذوب: 58
4-4-2.تعيين غلظت مناسب پروب: 59
4-5. نتايج Real-Time PCR 60
4-5-1. آمار توصيفي: 60
4-6. درصد بيان ژن ARMC3 63
4-7. درصد بيان ژن TPTE 65
4-8. درصد بيان ژن TTK 67
4-9. بررسي درصد بيان همزمان ژن‌هاي سرطاني- بيضه‌ايي 69
فصل پنجم: بحث، نتيجه گيري و پيشنهادها 70
پيشنهادات 74
Abstract: 76
References: 77

فهرست جداول

جدول3-2: دستورالعمل انجام واکنش بر اساس کيت سازنده 49
جدول3-3 :جدول برنامه زماني Real-timePCR 49
جدول 4-1. خلاصه اي از اطلاعات دموگرافيک. 53
جدول 4-2 :نتايج اندازه گيري غلظت RNA در چند نمونه مجاور تومور و تومور 54
جدول 4-3 . نتايج غلظت RNA تيمار شده در چند نمونه تومور و مجاور تومور 55
جدول4-4: توالي پرايمر و پروب استفاده شده در روش Real-Time PCR 56
جدول4-5 : چرخه هاي آستانه براي ژنها با غلظت هاي مختلف پرايمر 57
جدول 4-6: غلظت هاي بهينه پرايمر و پروب ها 58
جدول4-7: آمار توصيفي چرخه هاي آستانه. 60
جدول4-8: درصد بيان ARMC3 در نمونه هاي نرمال، تومور و مجاور تومور. 63
جدول4-9: درصد تغييرات بيان ARMC3 در نمونه تومور نسبت به مجاور 63
جدول4-10: ميانگين ct در بيان ARMC3 در گروههاي مختلف بياني. 64
جدول4-11 :تفاوت بيان ARMC3 در سه گروه افزايش، کاهش و عدم تغيير. 64
جدول4-12: درصد بيان TPTE در نمونه هاي نرمال، تومور و مجاور تومور. 65
جدول4-13: درصد تغييرات بيان TPTE در نمونه تومور نسبت به مجاور 65
جدول4-14: ميانگين ct در بيان TPTE در گروههاي مختلف بياني. 66
جدول4-15: تفاوت بيان TPTE در سه گروه افزايش، کاهش و عدم تغيير بيان. 66
جدول4-16: درصد بيان TTK در نمونه هاي نرمال، تومور و مجاور تومور. 67
جدول 4-17: درصد تغييرات بيان TTK در نمونه تومور نسبت به مجاور 67
جدول4-18. ميانگين ct در بيان TTK در گروههاي مختلف بياني. T 68
جدول4-19: تفاوت بيان TTK در سه گروه افزايش، کاهش و عدم تغيير بيان. 68
جدول4-20: بررسي درصد بيان همزمان ژن‌هاي سرطاني- بيضه‌ايي در نمونه‌هاي توموري 69

فهرست اشکال
شکل 1-1: شماتيکي از ساختار ميکروسکوپي پستان 8
شکل1-2: ARMC3 داراي 19 اگزون مي باشد 37
شکل 3-1. نمايي از برنامه دمايي دستگاه مورد استفاده 50
شکل 4-1. ظهور باندهاي18S و 28SRNA ريبوزومي حاصل از الکتروفورز نمونه هاي RNA بر ژل اگارز 8/0% 55
شكل4-2. نتايج اوليه بهينه سازي پرايمرها. 57
شکل4-3: منحني ذوب سمت راست ARMC3 وسط TPTE سمت چپ TTK 58
شکل 4-4. نتيجه انجام الکتروفورز بر روي محصولات PCR. 59
شکل 4-5. نمايي از Amplification Plot ژنهاي مورد بررسي. 62

فصل اول: مقدمه و اهميت موضوع

1-1: مقدمه
سرطان پستان شايع ترين سرطان در زنان (23 درصد از کل سرطان ها)، با وقوع بيش از يک ميليون مورد جديد در سال در سراسر جهان مي باشد و هنوز علت عمده مرگ و مير ناشي از سرطان در زنان با 411.000 مرگ و مير سالانه (14? از مرگ و مير ناشي از سرطان در زنان) بوده و روي هم رفته رتبه دوم مرگ و مير در دو جنس مرد و زن در سطح جهان را به خود اختصاص داده است.(1, 2). ميزان مرگ و مير ناشي از سرطان پستان در ايران 1.7 در هر 100.000 مورد گزارش شده است که نسبت استاندارد شده سني اين بيماري حدود 24 مورد در هر 100،000 زن در سال تخمين زده مي شود و با در نظر گرفتن اين نکته که ايران داراي حدود 35 ميليون زن مي باشد، اين آمار نشان دهنده 7000 مورد جديد سرطان پستان در سال مي باشد (3-5).
از آنجايي که زن به عنوان نقطه ثقل خانواده بوده و با درگيري زن به نوعي تمام افراد خانواده و حتي تربيت فرزندان نيز تحت تاثير قرار خواهد گرفت پرداختن به اين موضوع و يافتن راهکارهاي تشخيصي و درماني روز به روز اهميت بيشتري مي يابد. امروزه درمان سرطان پستان از طريق جراحي و سپس شيمي درماني يا اشعه درماني يا هر دو انجام مي شود. سرطان پستان در مراحل اوليه پيش آگهي خوبي داشته و عموما از طريق lumpectomy و اشعه درماني درمان مي شوند . سرطان هاي پيشرفته تر عموما از طريق جراحي (lumpectomy or mastectomy) و شيمي درماني وگاهي اوقات اشعه درماني درمان مي شوند . سرطان پستان متاستاز دهنده تقريبا غير قابل درمان است و از طريق ترکيبي از درمان ها کنترل مي شود (6, 7). علي رغم افزايش شيوع سرطان پستان ، بدليل تغيير تدابير درماني مرگ و مير آن کاهش يافته است. با اين وجود هنوز درصد قابل توجهي از کل موارد سرطان و مرگ و مير ناشي از آن مربوط به سرطان پستان است(8). رسيدن به روشهاي جديد درماني سرطان بسيار ضروري به نظر مي رسد و ايمني درماني امروزه به عنوان يک انقلاب در درمان سرطانها محسوب مي شود. يکي از اين روش ها تهيه واکسن ضد سرطان بوده که با تحريک پاسخ ايمني جهت تشخيص و نابود کردن سلول سرطاني استفاده مي شود. بعضي واکسنها مي توانند بر پايه آنتي ژنهاي ويژه باشند مانند CT آنتي ژنها (cancer-testis antigens) که به صورت ويژه در تومورها بيان مي شوند و بيان محدودي در ساير بافتها دارند(9).
CTآنتي ژنها اولين بار در سال 1991توسط Bruggen و همکارانش زماني که اولين آنتي ژن توموري به طور چشمگيري باعث تغيير پاسخ ايمونولوژي تومور شده بود، کشف شدند. آنها از طريق لنفوسيتهاي سيتوتوکسيک T مشتق شده از بيماران توموري در محيط آزمايشگاه( in vitro) ژن mz2 E که درسل لاين ملانوماي انساني بيان مي شد را شناسايي کردند(10) .
1-2: اهميت موضوع وضرورت انجام تحقيق
از آنجا که برخي از آنتي ژنهاي بيضه الگوي بيان محدودي دارند، اگر در سرطانها بيان شوند مي توانند ايمونوژنيک بوده و مرتبا توسط سيستم ايمني بيماران سرطاني تشخيص داده شوند، بنابراين مي توانند کانديداي مناسبي براي ايمونوتراپي سرطانها بوده و به عنوان بيومارکرهايي براي تشخيص زودرس سرطان نيز بکار روند(11). بر همين اساس بود که Scanlan و همکاران در مطالعه اي در سال 2002 ،CTAG ها را به عنوان اهداف مناسبي براي ايمونوتراپي سرطان ها معرفي کردند (12) .
ژنهاي سرطان – بيضه گروه هتروژني از پروتئين هاي ايمونوژنيک ( آنتي ژن هاي سرطان – بيضه Antigen = CTAG Cancer/Testis) را بيان مي کنند که اغلب به طور انحصاري در بافت نرمال بيضه و درصدي از انواع تومورهاي متفاوت بيان مي شوند . اين آنتي ژنها پروتئين هايي هستند که به طور طبيعي در سلولهاي زايشي مردان بيان مي شوند. اغلب اين آنتي ژنها در بيضه و بعضي از آنها نيز در تخمدان و تروفوبلاست ها بيان مي شوند. سلولهاي زايشي نارس (اووگوني و اووسيت اوليه) اين آنتي ژنها را بيان مي کنند اما بيان آنها در فوليکول و اووسيت ديده نشده است. در بيضه محل حضور اين آنتي ژنها به طور معمول در فضاي بينابيني بيضه بوده و اين سلولها هيچ وقت در توبولهاي semin ferous ديده نمي شوند.
بر طبق اطلاعاتي که در پايگاه اطلاعاتي ژن سرطان – بيضه ( Cancer/Testis Gene Database ) وجود دارد ، تا کنون بيش از 150 عضو از اين خانواده ژني سرطان – بيضه شناسايي شده است (13). بر اساس اختصاصيت بافتي و ايمونوژنيسيته Cancer Testis Antigen ها و به اين دليل که آنها در اغلب بافتهاي نرمال بيان نمي شوند بنابراين در صورت بيان آنها در بافت توموري مي توان از آنها به عنوان کانديداي مناسبي براي ايمونوتراپي سرطان و تهيه واکسن سرطان بر اساس اين آنتي ژن ها استفاده کرد. لازم به ذکر است که در نمونه هاي مختلف از بافت هاي تومورال انواع مختلفي از اين نوع ژن ها بيان مي شوند که با وجود اشتراکات زياد در بيان آنها، کميت آنها در هر بافت متفاوت است. بر اين اساس کميت بيان اين ژن ها نيز در ايمونوتراپي سرطان ها اهميت دارد(14). از جمله نکات مثبت استفاده از روش هاي ايمونوتراپي در در مان سرطان و اينگونه واکسن ها، مي توان به عوارض اندک اين روش ها اشاره کرد. بسياري از مطالعات فاز 1 که در آنها انواع مختلفي از اين واکسن ها در مورد تعدادي از بدخيمي ها استفاده شده است، به بي ضرر بودن اين روش ها اشاره داشته اند(15).

1-3: اهداف طرح
1-3-1: هدف کلي
بررسي بيان ژنهاي سرطاني -بيضه اي (Cancer / Testis Genes) TTK ،ARMC3 ، TPTE در نمونه بافت بيماران مبتلا به سرطان پستان و مقايسه آن با بافت نرمال
1-3-2: اهداف فرعي
بررسي بيان ژن TTK در نمونه بافت سرطان پستان
بررسي بيان ژن TTK در نمونه بافت نرمال پستان
بررسي بيان ژن ARMC3در نمونه بافت سرطان پستان
بررسي بيان ژن ARMC3در نمونه بافت نرمال پستان
بررسي بيان ژن TPTE در نمونه بافت سرطان پستان
بررسي بيان ژن TPTE در نمونه بافت نرمال پستان
مقايسه بيان ژن TTK در نمونه بافت سرطان پستان با نمونه بافت نرمال پستان

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید