500 رسانده شد.
* بايد دقت شود که بافرهاي با غلظت زياد در حجم کم تهيه شود تا تحت تاثير عوامل محيطي، بافر پايداري خود را از دست ندهد و رسوب نکند.
3-5-2- محلول رنگ آميزي DNA Stain
در اغلب آزمايشگاه‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ بيولوژي مولکولي از محلول اتيديوم برومايد استفاده مي‌‌‌‌‌‌‌‌شود. اتيديوم برومايد يک ماده موتاژن قوي مي‌‌‌‌‌‌‌‌باشد و در نتيجه در استفاده از آن بايد توجه زيادي شود. بنابراين در اين مطالعه از يک ماده جايگزين اتيديوم برومايد استفاده شد. محلول DNA Stain يک ماده ايمن براي رنگ آميزي نوکلئيک اسيد مي‌‌‌‌‌‌‌‌باشد که از لحاظ کارايي با اتيديوم برومايد تفاوتي ندارد. براي استفاده از اين ماده به ازاي 100 ميلي ليتر ژل آگارز، µl 8-6 DNA Stain استفاده مي‌‌‌‌‌‌‌‌شود.
3-6-استخراج DNA از خون
در اين مطالعه براي استخراج DNA از کيت ATP استفاده شد که اساس آن روشSalting out – کلروفرم است. لازم است قبل از شروع کار، کليه وسايل و مواد مورد نياز ( ميکروتيوپ ها، سمپلر و سر سمپلر، محلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ليز کننده و…) روي ميز کار قرار داده شود. دقت شود که اتانول در فريزر باشد تا موقع استفاده سرد باشد و کليه وسايل اتوکلاو شده باشند.
به منظور استخراج DNA به ترتيب عمل شد:
1. 500 ميکروليتر از نمونه خون که در لوله‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ حاوي EDTA است، در ويال‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌5/1 يا 2 ميلي ليتري قرار داده شد.
2. به نمونه خون، 500 ميکروليتر بافر ليز کننده سلولي اضافه کرده و با سر و ته کردن ويال سعي شد سلول‌ها تخريب شوند. مجددا? 1000 ميکرو ليتر بافر ليز کننده سلولي اضافه شد و با سر و ته کردن ويال يا ورتکس کردن ليز سلولي ادامه يافت‌‌.
3. سپس مخلوط به دست آمده به مدت 4 دقيقه با دور g7000 سانتريفيوژ شده و مايع رويي دور ريخته شد.
4. مجددا? 500 ميکروليتر بافر ليز کننده سلولي به رسوب اضافه شد‌‌‌‌‌ و مرحله دو و سه تکرار شد و سعي شد هر بار رسوب از ويال جدا شده و در بافر معلق شود و مرحله 3 تکرار شد.
5. سپس 300 ميکروليتر بافر ليز کننده هسته‌اي به رسوب اضافه شده و ويال‌‌ها به مدت 30 دقيقه در دماي اتاق قرار داده شد.
6. پس از آن 100 ميکروليتر NaCl 6M و 600 ميکروليتر کلروفرم به ويال اضافه کرده و مخلوط شد.
7. سپس ويال‌‌ها را حدود 15 ثانيه ورتکس کرده تا محلول همگني به دست آيد.
8. سپس ويال‌ها به مدت 4 دقيقه با دور g 7000 سانتريفيوژ گرديد که در اين مرحله 3 فاز ديده شد که فاز رويي حاوي DNA است.
9. با دقت 300 ميکروليتر از محلول رويي را در تيوب جديد ريخته‌‌‌‌‌‌ و فازهاي ديگر دور ريخته شد. ( اين مرحله بايد با دقت انجام شود تا از فاز‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ديگر بر داشته نشود).
10. 1000 ميکروليتر اتانول 100% سرد (که قبلا در 20- درجه سانتي‌گراد قرار داده شده‌است) به ويال اضافه شده و به آهستگي سروته شده تا کلاف DNA مشاهده شود (گاهي اوقات ممکن است کلاف ديده نشود).
11. سپس به مدت 2 دقيقه دورg 10000 سانتريفيوژ شد.
12. محلول رويي دور ريخته شده و 700 ميکروليتر اتانول 70% سرد براي شستشوي DNA اضافه شده و آهسته تکان داده شد و مرحله 11 مجددا تکرار گرديد‌‌‌.
13. محلول رويي دور ريخته شد و ميکروتيوب‌ها به صورت وارونه روي يک دستمال قرار داده ‌‌‌‌شدند تا خشک شوند و الکل تبخير شود. حدودا” 30 دقيقه کافي است.
14. در نهايت حدود 100-50 ميکروليتر آب دو بار تقطير استريل به ميکروتيوب ها اضافه گرديد، در اين مرحله مي‌‌‌‌‌‌‌‌توان به جاي آب از بافر (Trise-EDTA)TE نيز استفاده کرد و DNA استخراج شده در دماي 4 درجه سانتي نگهداري مي‌‌‌‌شود.
3-7- تهيه ژل آگارز و الکتروفورز
بسته به درصد ژل آگارز مورد نياز، ژل تهيه مي‌‌‌‌‌‌‌‌گردد که براي تهيه cc20 ژل آگارز 2% به ترتيب زير عمل شد:
1- 3/0 گرم پودر آگارز در يک ارلن ريخته و با 20 ميلي ليتر بافر TBE1X مخلوط کرده و با استفاده از دستگاه ماکروويو حرارت داده شد، تا شفاف شود.
2- سپس به آن مقدار µl 2/1 DNA Stain افزوده شد.
3- در مرحله بعد ژل در سيني حاوي شانه ريخته شد. پس از سفت شدن ژل، شانه به آرامي برداشته شده و سيني داخل تانک حاوي بافر قرار داده شد. لازم به ذکر است که بايستي بافر چند ميلي‌متر روي سطح ژل را بپوشاند.
4- محصول PCR يا DNA تام استخراج شده با بافر سنگين کننده (6X) (به اندازه ي 2/0 حجم محصول PCR يا DNA تام)، مخلوط شده و به درون چاهک انتقال داده شد.
5- جريان در دستگاه با ولتاژ 140 ولت برقرار شد.
6- پس از اينکه رنگ پيشرو دو سوم طول ژل را طي کرد، ولتاژ قطع گرديد و ژل از درون تانک خارج شد و سپس با استفاده از دستگاهGel documentation عکس برداري انجام گرفت.
3-8- طراحي پرايمر
براي مشخص کردن SNP‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ناحيه پروموتري ژن GKN1، ابتدا با نرم افزار oligo، پرايمر‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ اختصاصي مورد نظر طراحي گرديد و با استفاده از سايت Pubmed توالي پرايمرها BLAST گرديد تا اختصاصيت آن‌ها مورد بررسي قرار گيرد و پرايمرها توسط شرکت ماکروژن کره با واسطه شرکت زيست پيشگام ايران سنتز شد.
3-9- تکثير ناحيه پروموتري ژن GKN1
پس از طراحي پرايمرهاي مناسب، دو ناحيه از پروموتر ژن GKN1 به نام‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ فرضي GKN1A و GKN1B با تکنيک PCR تکثير شد. توالي پرايمرها، شرايط PCR و مواد مورد نياز PCR به ترتيب در جدول 3-1، 3-2 و 3-3 آمده است.

جدول 3-1: توالي پرايمرهاي GKN1A و GKN1B
پرايمر
توالي

اندازه محصول

GKN1A رفت12 پرايمر
GKN1A پرايمر برگشت13

GKN1B پرايمر رفت
GKN1B پرايمر برگشت

5-ATGCACTTCAGAAAGACAACC-3
5-CATGAGCCAGTGTACCAGGA-3

5-CAACAAGTGATGAGTCAGGT-3
5-GTCCATGTGTTTGAAGAGAG-3

628 bp

390bp

جدول 3-2: شرايط PCR جهت تکثير ناحيه پروموتري ژن GKN1 (GKN1A و GKN1B )

جدول 3-3: ميزان مواد مورد نياز PCR جهت تکثير ناحيه پروموتري ژن GKN1
غلظت ذخيره14
غلظت نهايي
حجم مورد نياز(µl)
ماده
50ng? µl
2ng? µl
6/0
DNA Template
10X
1X
5/1
10X PCR buffer
50mM
5/1mM
45/0
MgCl2
5mM
2/0mM
6/0
dNTP
5u ?µl
1u
1/0
Taq DNA Polymerase
5pmol
2/0pmol
6/0
F15 – Primer
5pmol
2/0pmol
6/0
R16 -Primer

55/10
D.D.W

15
Total Volume

3-10- توالي يابي
پس از تکثير نواحي پروموتري مورد نظر، پس از اطمينان از صحت تکثير و کيفيت مناسب باند، در صورتي که باند مورد نظر شارپ باشد حدود 22 ميکروليتر از محصول PCR در يک ويال استريل قرار داده و به همراه 120 ميکروليتر پرايمر (پرايمر رفت براي GKN1A و پرايمر برگشت براي GKN1B) با غلظت 10 پيکومول در يک ويال جداگانه که درب آن‌ها پارافيلم شده است، به خارج از کشور (کره جنوبي) جهت توالي يابي ارسال شد. توالي يابي براي هر ناحيه براي 10 نمونه انجام گرفت.
3-11- شناسايي SNP‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ پروموتر ژن GKN1
پس از توالي يابي، براي شناسايي SNP ناحيه پروموتري، ‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ابتدا با نرم افزار Chromas توالي نوکلئوتيدي هر نمونه خوانده شد و سپس با نرم افزار SeqMan با يکديگر مقايسه شدند.
3-12- تکنيک Tetra- primer ARMS- PCR
روش‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ مبتني بر آنزيم، براي تشخيص پلي مورفيسم پر هزينه و وقت گير مي باشد. تکنيکTetra- primer ARMS- PCR يک روش ساده، مقرون به صرفه و سريع براي تعيين ژنوتيپ پلي مورفيسم‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ تک نوکلئوتيدي (SNP) با استفاده از 4 پرايمر در يک واکنش PCR به صورت همزمان مي باشد. در اين روش از يک جفت پرايمر خارجي و يک جفت پرايمر داخلي استفاده مي شود که پرايمرهاي داخلي به صورتي طراحي مي‌‌‌‌‌‌‌‌شوند که انتهاي ?3 آن‌ها اختصاصي SNP مي‌‌‌‌‌‌‌‌باشد )شکل 3-1).
در اين روش عوامل زيادي مي‌‌‌‌‌‌‌‌توانند به عنوان مداخله گر عمل کنند بنابراين کيفيت استخراج DNA، غلظت مواد از جمله غلظت Mgcl2 و غلظت پرايمرها بسيار مهم است. متعادل کردن پرايمر‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ داخلي يک مرحله کليدي محسوب مي‌‌‌‌‌‌‌‌شود و مي‌‌‌‌‌‌‌‌توان با افزايش غلظت پرايمر‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ داخلي اين تعادل را ايجاد کرد (51، 52 و 53).

شکل 3-1: نمايي از تکنيک Tetra Primer ARMS- PCR

3-13- تعيين ژنوتيپ SNP با شناسه‌هاي rs4575760 و rs4072127 با روش Tetra- primer ARMS- PCR
پس از مشخص شدن SNP‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌هاي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌ ناحيه پروموتري ژن GKN1 با توالي يابي، در بقيه افراد براي تعيين ژنوتيپ rs4575760 و rs4072127 از روش Tetra- primer ARMS PCR استفاده شد.

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید