سرطان پستان انتخاب شده اند. البته اين انتخاب با توجه به مطالعاتي که پيشاپيش در دنيا صورت گرفته، انجام شده است.
2-4-5-1: ARMC3 (Armadillo repeat-containing 3)
از خانواده CT 81 بوده به نامهاي ديگري مثل FLJ25845 , FLJ32827 , RP11-300B11.1 نيز شناخته مي شود. در بازوي کوتاه کروموزوم 10(10p12.31) قرار دارد. اين آنتي ژن با استفاده از روشهاي ايمنولوژيکي در سال 2006 و در مطالعه Okada شناسايي شد.(63) پروتئيني872 اسيد آمينه اي بنام Armadillo repeat-containing protein 3 را کد مي کند که عملکرد آن به خوبي شناخته نشده است. الگوي بيان اين ژن از دسته selective testis- مي باشد. دومين هاي Armadillo/beta-catenin-like (ARM) تکرارهاي ناکاملي از 45 اسيد آمينه هستند که در ارتباطات بين پروتئيني نقش دارند. پروتئين هاي داراي دومين ARM مثل ARMC3 در signal transduction ، توسعه، چسبندگي و تحرک سلولي ، و شروع تومور و متاستاز آن نقش دارند(65). بيان اين نيز در مطالعات مختلف و در سرطانهاي گوناگوني بررسي شده است که به عنوان مثال مي توان به اين موارد اشاره کرد. در يک مطالعه در سال 2006 بيان در سطح mRNA با استفاده از روش RT-PCR در سرطان پانکراس 33% گزارش شده است(63). در همان مطالعه بيان آن در سرطان ريه 38% گزارش شده است. بررسي بر روي سل لاين هاي سرطان پستان و نمونه هاي انساني صورت نگرفته است. اين ژن داراي 19 اگزون مي باشد(شکل 1-2).

شکل1-2: ARMC3 داراي 19 اگزون مي باشد

2-4-5-2: TPTE (Transmembrane Phosphatase With Tensin Homology)
از خانواده CT 44 بوده به نامهاي ديگري مثل PTEN2نيز شناخته مي شود. در بازوي کوتاه کروموزوم 21 (21p11) قرار دارد. عمل اين ژن به خوبي شناخته نشده است ولي شواهدي مبني بر مهم بودن آن در پروسه اسپرماتوژنز وجود دارد. اولين بار با استفاده از روشهاي in silico و بررسي پايگاه داده ها مشخص شد(66).
پيش بيني حضور دومين غشايي در TPTE نشان مي دهد که پروتئين هاي کد گذاري شده توسط آن مي تواند در signal transduction به ويژه در روند اسپرماتوژنز و عملکرد غدد درون ريز بيضه مهم باشند(67). در مطالعه اي که Dong و همکارانش در سال 2003 و با استفاده از تکنيک RT-PCR صورت گرفته بيان در سطح mRNA در کارسينوماي هپاتوسلولار 39% گزارش شده است. همچنين در بررسي انجام شده در سرطان ريه بيان 36% بوده است(66).در همين مطالعه برروي سل لاين سرطان پانکراس با روش Northern blot نيز بررسي صورت گرفته است ولي مطالعه اي بر روي نمونه هاي سرطان پستان صورت نگرفته است. اين ژن داراي 4 ايزوفرم مي باشد.

2-4-5-3: TTK (threonine/tyrosine kinase)
از خانواده CT 96 بوده به نامهاي ديگر ESK; PYT; MPS1; MPS1L1 نيز شناخته مي شود. در بازوي بلند کروموزوم 6 (6q13-q21) قرار دارد ، در انواع مختلفي از سرطانها در هر دو سطح mRNA و پروتئين بيان مي شود. توسط متدهاي مولکولي در مطالعه Mills(68) در سال 1992 و مطالعه Lindberg (69) در سال 1993 شناسايي شده و در مطالعه اي در سال 2008 توسط Mizukami و همکارانش به عنوان يک CT شناخته شد(64) .يک سرين-ترئونين و تيروزين پروتئين کيناز مي باشد که به عنوان يک تنظيم کننده در مونتاز دوک ميتوزي عمل مي کند(70). از طريق يک تعامل مستقيم و فسفوريلاسيون borealin و تنظيم فعاليت کيناز B Aurora اصلاح اتصال کروموزوم نامناسب را کنترل مي کند(71). TTK يا MPS1 به همراه يک پروتئين ديگر بنام Hec1 براي از سر گيري يا اجتماع Mad1/Mad2 در کينوتوکور لازم مي باشد(72). اين پروتئين در ارتباط با تکثير سلولي بوده و پروتئيني ضروري براي چيدمان کروموزوم در طي ميتوز در سانترومر است و براي Duplicatin سانتروزوم مورد نياز است. مطالعه Wei و همکارانش در سال 2005 نيز نشان داد که TTK بطور مستقيم CHK2 را فسفريله مي کند که نقش مهمي در نقطه بازرسي ناشي از آسيب DNA در چرخه سلولي دارد که پيشنهاد کننده تداخل احتمالي بين نقطه بازرسي مونتاژ دوک و بازرسي آسيب DNA مي باشد (73) . همچنين TTK مي تواند در آپوپتوز ناشي از آسيب DNA و P53 نقش داشته باشد(74). بيان آن در سرطانهاي مختلف گزارش شده است. يک مطالعه در سال 1992 توسط Mills به روش Northern blot صورت گرفته که بيان اين ژن در سطح mRNA در سرطان تخمدان حدود 83% گزارش شده است. و باز هم در همان مطالعه بيان آن در سرطان ريه 100% گزارش شده است(68). همچنين با استفاده از روش qRT-PCR بيان در سطح mRNA قبلا در سل لاين هاي مختلف سرطان پستان مثل MDA-MB-231 و MCF7 بررسي شده که بيان 100% گزارش شده است(75). بررسي بيان اين ژن در سطح mRNA در نمونه هاي سرطان پستان مطالعه نشده است. اين ژن داراي 2 ايزوفرم مي باشد ولي از آنجايي که بيان هر دو از نظر وجود يا عدم وجود در بافت توموري حائز اهميت مي باشد در نتيجه پرايمر و پروب طوري طراحي خواهند شد که بتواند هر دو ايزوفرم را مورد شناسايي قرار دهد.
2-5: مباني تئوريك در Real-Time PCR
مزيت اصلي Real-Time PCR اين است که با رديابي ميزان تکثير محصول در هر دوره مقدار الگوي اوليه را به طور دقيق تعيين مي کند، در حالي که در روش مرسوم، محصول واکنش در انتها اندازه گيري مي شود. بعلاوه Real-Time PCR روش سريعي است که ممکن است چند نوع ژن را به طور همزمان آناليز کند و ديگر نيازي به روش هاي تعيين مقدار پس ازPCR نيست. به علت حذف مراحل آناليز پس از PCR ، وقوع آلودگي کاهش مي يابد و بازده بالاتري حاصل مي شود. اگر چه Real-Time PCR مزاياي بسياري نسبت به روش هاي مرسوم دارد، معايبي نيز دارد: هزينه بالاتر و ناتواني در تشخيص اندازه محصول مي تواند بين تکثير cDNA و DNA مشکل ايجاد نمايد(76, 77).
در Real-Time PCR سيگنال فلوروسنت با استفاده از ترموسايکر هايReal-Time PCR تشخيص داده مي شود. همه اجزاي مورد استفاده در روش هاي متداولRT-PCR در Real-Time PCR نيز وجود دارد اما علاوه بر آنها يک گزارشگر فلورسنتي مثل يک رنگ متصل شونده به DNA يا يک پرايمر اوليگونوکلئوتيدي فلورسنت نيز در واکنش حضور دارند. گزارشگر فلورسنتي تنها زماني نور فلورسنس را ساطع مي کند که محصول تکثير شده باشد، لذا افزايش سيگنال فلورسنس ثبت شده نسبت مستقيمي با افزايش محصول در واکنش دارد. هرچه غلظت الگو بيشتر باشد، افزايش معني دار فلورسنس زودتر مشاهده مي شود. شدت سيگنال فلورسنس در مراحل اوليه تکثير به طور عمومي 3 تا 15 چرخه اول تغيير نمي کند يا تغييرات بسيار جزئي نشان مي دهد و اين ميزان فلورسنس، فلورسنس زمينه يا خط پايه در نظر گرفته مي شود. آستانه فلورسنس را بايد کمي بالاتر از اين خط پايه در نظر بگيريم، در اين حالت افزايش معني داري در شدت فلورسنس در دستگاه ثبت خواهد شد، زيرا شدت سيگنال بالاتر از ميزان آستانه بوده است که به آن ” چرخه آستانه ” يا CT مي گويند. با دانستن ميزان CT براي يک واکنش و رسم يک منحني استاندارد غلظت cDNA شدت فلورسنس در مقابل غلظت cDNA، مي توان به غلظت الگوي اوليه پي برد(76, 77).
2-5-1. کنترل داخلي :
انتخاب ژن هاي کنترل داخلي براي نرمال سازي نتايج و همچنين نشان دادن حضور بازدارنده و يا کيفيت ساخت cDNA مهم است . مقدار CT ممکن است از شرايطي به شرايط ديگر بر اساس بهره وري تخليص تغيير کند و آن تغيير به علت تفاوت در نمونه ها نيست. بنابراين پيدا کردن يک کنترل داخلي مناسب که تحت تاثير افزايش يا کاهش بيان در مقايسه با ژن هاي مورد بررسي درآن تحقيق مشخص قرار نگرفته اند بسيار مهم است. ژن هاي House Keeping معمولا ژن هاي هاي ساختاري اند که براي نگهداري عملکرد اوليه سلولي مورد نيازند، و در تمام سلول هاي يک ارگانيسم در شرايط طبيعي و پاتوفيزيولوژيکي بيان مي شوند. در اين مطالعه ژن بتااکتين((ACTB به عنوان کنترل داخلي در نظر گرفته شد.

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1: نمونه گيري
نمونه ها از بانک زيستي پژوهشکده سرطان پستان جهاد دانشگاهي تامين شدند که نمونه هاي بافت توموري از بين بيماران سرطان پستان مراجعه كننده به كلينيك سرطان پستان پژوهشكده سرطان پستان جهاد دانشگاهي جمع آوري شده است. تمام بيماران اهدا کننده فرم رضايت نامه جهت استفاده از نمونه هاي بافتي آنها در انجام پروژه تحقيقاتي را امضا کرده بودند. همچنين بانک ملزم به رعايت اصول اخلاقي مربوطه در زمينه جمع آوري و استفاده از نمونه ها مي باشد. نمونه توسط جراحان در اتاق عمل استخراج گرديده و پس از تائيد پاتولوژي در اين بانک زيستي ذخيره مي شوند. بافت هاي مورد استفاده در اين پايان نامه شامل سه گروه زير بودند:
بافت توموري متعلق به زنان مبتلا به سرطان پستان از نوع داکتال کارسينوماي مهاجم.
بافت مجاور تومور بافت سرطاني متعلق به زنان مبتلا به سرطان پستان از نوع داکتال کارسينوما ي مهاجم. (از ان جهت که تشخيص مقدار حاشيه توموري در سرطان پستان بسيار اهميت دارد)
بافت پستاني سالم متعلق به زنان سالمي که به دلايلي غير از بيماري (عمدتا جهت عمل جراحي هاي زيبايي)، مورد عمل جراحي قرار گرفته شدند .
3-1-1 .روش جمع آوري و تعداد نمونه ها
نمونه هاي بافت پستاني اشاره شده در بالا بصورت fresh – frozen با ازت مايع منجمد شده و تا زمان انجام آزمايش ها در فريزر 70- درجه سانتي گراد نگهداري مي شدند. براي برش زدن ميزان لازم از بافت هاي مذکور جهت استخراج RNA هر يک از بافت ها درون يک پليت خاص بر روي يخ خشک برش زده و سپس توزين شدند. ميزان لازم براي استخراج RNA 8 الي 10 ميلي گرم منظور گرديد. سپس بافت مذبور به ميکروتيوب هاي 5/1 استريل عاري از DNAse/RNAse منتقل ، نامگذاري و مجددا تا زمان استفاده به فريزر 70- درجه سانتي گراد منتقل گرديد.
در نهايت تعداد 95 نمونه شامل40 نمونه ، 40 نمونه مجاور تومور متعلق به بيماران مبتلا به داکتال کارسينوماي پستان و 15 نمونه نرمال متعلق به افراد نرمال عاري از سرطان پستان از بانک زيستي اخذ شد. تعداد 2 نمونه بافت human testis (بافت بيضه ) از پژوهشگاه رويان پس از هماهنگي هاي لازم تهيه گرديد تا به عنوان نمونه کنترل مثبت مورد استفاده قرار گيرد.
3-2.استخراج RNA از نمونه بافتهاي جمع آوري شده
3-2-1 . محلول هاي مورد نياز
1-محلول RNX-Plus
2-کلروفرم
3-اتانول 70%
4- ايزوپروپانول
5-آب DEPC
3-2-2. روش استخراج RNA از بافت
استخراج RNA با استفاده از محلول RNX-Plus انجام شد. RNX-Plus يک محلول شامل گوانيدين-فنول بوده که جهت استخراجRNA توتال از نمونه هاي همگن شده بکار مي رود. در اين پروسه عملکرد نمک گوانيدين موجب رسوب DNA و پروتئين در فاز فنولي مي گردد در حاليکه فاز ابي شامل انواع RNA ژنومي با کيفيت بالا مي باشد.
بافت هاي برش داده شده درون ميکروتيوب هاي عاري از DNAse/RNAseبه درون يخ منتقل گرديد و از اين پس کليه مراحل تکنيک بر روي يخ انجام شد. ابتدا بافت کاملا با پلت ميکسر که نوعي خرد کن مي باشد خرد و له گشته و روي آن به ميزان 200 ميکرو ليتر محلول RNX ريخته شد. له کردن بافت تا زماني که مخلوط کاملا همگن گردد ادامه يافته و سپس 800 ميکروليتر ديگر از محلول RNX به لوله اضافه گرديد. بعد از 5 دقيقه 150 ميکروليتر آب قابل تزريق به لوله مذبور اضافه شده و چند بار وارونه گشته تا خوب مخلوط گردد. سپس 200 ميکرو ليتر کلروفرم به محتويات لوله اضافه و به مدت 10 ثانيه ورتکس گرديد تا رنگ محلول سفيد يا شيري

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید