گذار باشد. Umezu و همکاران نشان دادند که تزريق داخل صفاقي و داخل وريدي منتول و همينطور ايزومر‌هاي منتون و ايزومنتون به موش منجر به افزايش وابسته به دوز در فعاليت حرکتي مي‌شود در واقع منتول از طريق عمل کردن روي سيستم عصبي مرکزي باعث چنين اثري مي‌شود (Umezu, et al., 2001). منتول مي‌تواند به راحتي جذب شود، سپس با عبور از سد خوني مغزي (با توجه به ماهيت ليپوفيلي خود) اثرات خود را روي نورون‌هاي سيستم عصبي مرکزي (CNS) اعمال کند (de .Araujo,et al., 2011).
Zhang و همکاران (2008) اثرات منتول را در CNS بررسي کردند و اعمال مرکزي منتول را در نورون‌هاي ناحيه هيپوکامپ نشان دادند. به طور جالب توجهي آن‌ها عملکرد اختصاصي منتول را در توقيف تحريک نورون‌هاي هيپوکامپ با افزايش انتخابي مهار تونيک GABAA نشان دادند. اين يافته بسيار نزديک به اين زمينه است که منتول مي‌تواند به عنوان يک داروي ضد صرع استفاده شود. از طرفي هوشمندي در سال 2012 گزارش کرد که منتول نه تنها اثر ضدصرعي ندارد بلکه با القاء فعاليت انفجاري و انحراف دپولاريزان در نورونهاي حلزون داراي اثر صرعزايي مشابه الگوي صرعي ايجاد شده تحت تأثير پنتيلن تترازول ميباشد.
تاثير صرع‌زايي اسانس روغني از جمله کامفر نيز به اثبات رسيده است (Burkhard, et al., 1999). گزارشاتي وجود دارد که برخي از بيماران پس از مصرف ناخواستهي کافور تشنج تونيک-کلونيک ژنراليزه را تجربه کردند (Agarwal and Malhotra, 2008). ?uli? و همکاران در سال 2008 گزارش کردند که تزريق درون صفاقي کامفر در دوزهاي 400-600 ميکروليتر بر کيلوگرم سبب القاي تشنجات صرعي در موشهاي صحرايي نر ميشود. کامفر کانال‌هاي TRPV1,3 را فعال ميکند و کانال‌هاي TRPA1 را که در نورون‌هاي گانگليون ريشه‌ي پشتي گيرنده درد بيان مي‌شوند را مهار ميکند ) (Nagata et al., 2005. اين كانالها اطلاعات مربوط به دما و درد را به سيستم عصبي مركزي انتقال ميدهد و در سلولهاي عصبي مختلف بيان ميشود.

2-2) هدف:

در اين تحقيق هدف ما، بررسي تاثيرکامفر بر تحريک‌پذيري سلول‌هاي عصبي و بررسي نقش عملکردي کانال‌هاي يوني وابسته به ولتاژ در تحريک‌پذيري نوروني و مشارکت احتمالي آنها در تعديل فعاليت نوروني توسط کامفر در نورونهاي حلزون ميباشد.

فصل سوم

مواد و روشها

3-1) حيوانات

مدل آزمايشگاهي مورد استفاده در کليه آزمايش‌ها، حلزون باغي (Caucasotachea atrolabiata, krynicki, 1833) بود (شکل 3-1). نمونه بالغ حلزون باغي، داراي صدف بزرگي با قطر تقريبي 3 سانتيمتر راست گرد، فشرده (طول کمتر از عرض) و داراي 4 تا 5 پيچ در طول صدف مي‌باشند. صدف در رنگ‌هاي مختلف و معمولا به رنگ قهوهاي تيره يا شاه بلوطي با نوارهاي زرد رنگ ديده مي‌شود. نمونه‌ها در شرايط مناسب از لحاظ درجه حرارت مناسب، نور و در محيط مرطوب نگهداري و با هويج، خيار و کاهو تغذيه ميشدند.

شکل 3-1. حلزون باغي(Caucasotachea atrolabiata)

3-2) تشريح و آماده سازي گانگليون عصبي جهت ثبت

آزمايش‌ها بر روي نورون‌هاي مجموعه گانگليوني تحت مري65 انجام مي‌گرفت (شکل 3-2). قبل از انجام آزمايش، بمنظور ايجاد شرايط فيزيولوژيک يکسان و حصول اطمينان از فعال بودن جانور، آن‌ها را درون ظرف آب قرار داده و پس از فعال شدن ابتدا صدف جانور بوسيله انبر استخوان شکن برداشته شده و سپس به کمک سوزن سر و پاي حلزون بدون صدف روي چوب پنبه ثابت مي‌شد. با ايجاد شکافي طولي در ناحيه گردن جانور، حلقه گانگليوني دور مري شناسايي و از بدن خارج شده و به داخل محفظه ثبت با بستر سيلگارد و حاوي رينگر نرمال حلزون منتقل و سپس با سوزن حشره در اين محفظه تثبيت مي‌شد. نورون‌ها در اين مجموعه گانگليوني بوسيله دو لايه بافت پيوندي احاطه شده‌اند. بخش پشتي گانگليون داراي اعصاب کمتري بوده و با برداشتن لايههاي پيوندي در اين ناحيه، توسط پنس‌هاي بسيار ظريف در زير استريوميکروسکوپ، نورون‌ها آشکار مي‌شدند.

شکل 3-2. گانگليون تحت مري تثبيت شده در محفظه ثبت

3-3) محلولها و داروها

محلول رينگر نرمال حلزون شامل (بر حسب ميلي مولار):
NaCl (80)، (10) CaCl2، MgCl2 (5)، KCl (4)، HEPES (5) و Glocuse (10)بود (Taylor, 1987) و PH آن به کمک دستگاه PH متر و با استفاده از Trisma base در حد 6/7-4/7 تنظيم مي‌گرديد. همچنين محلول رينگر فاقد سديم نيز با جايگزين کردن NaCl به ميزان معادل از Trise-HCl تهيه ميشد و PH آن مشابه قبل تنظيم ميگرديد.
کامفر (Sigma, USA) در يخچال نگهداري مي‌شد. قبل از انجام آزمايش‌ها غلظت‌هاي مناسب آن تهيه و در حين انجام آزمايش دوزهاي مورد نظر به محفظه ثبت سلولي افزوده مي‌شد. با توجه به حلاليت پايين کامفر در آب ازDMSO بعنوان حلال اوليه محلول ذخيره کامفر استفاده مي‌شد.
ساير داروها شامل نيکل کلريد (مهارکننده غيراختصاصي کانال‌هاي کلسيمي) ،کلريترين (مهارکننده PKC ) و H89 (مهارکننده PKA)، سديم نيترو پروسايد66(آزادکننده نيتريکاکسيد) نيز در يخچال نگهداري و مورد استفاده قرار گرفت.

3-4) ثبت داخل سلولي

پتانسيل‌هاي عمل خودبخودي و برانگيخته در شرايط کنترل و متعاقب تيمارهاي مختلف با روش تثبيت جريان با استفاده از آمپلي فاير (npi, Germany) SEC-10LX ثبت گرديد. ميکروالکترودهاي مورد استفاده از ميکروپيپت‌هاي ديواره نازک از جنس بروسيليکات (USA) و با کمک يک ميکروالکترود پولر افقي (Sutter Instrument, USA) تهيه مي‌شد. الکترودها با محلول KCl سه مولار پر شده و نمونه‌هاي بدون نشت که 5-1 مگا اهم مقاومت داشتند جهت ثبت مورد استفاده قرار مي‌گرفتند. يک سيم نقره با روکش کلريد نقره محلول داخل ميکروالکترود شيشهاي را به ورودي پرهآمپلي فاير وصل مي‌کرد. در تمام آزمايش‌ها از يک پل آگار بعنوان الکترود مرجع استفاده مي‌شد که محلول محفظه ثبت را به پتانسيل صفر (زمين) وصل مي‌کرد (شکل3-3). پس از ورود الکترود به نورون، ثبت پايه براي حدود پنج دقيقه به عمل مي‌آمد و درصورتي که نورون داراي پتانسيل پايدار پايينتر از mV37- بود، ثبت پتانسيل‌هاي غشائي در وضعيت تثبيت جريان در شرايط کنترل و متعاقب تيمارهاي مختلف به عمل مي‌آمد. داده‌هاي ثبت شده توسط يک مبدل آنالوگ-ديجيتال HEKA, Germany)) رقمي شده و به کمک نرم افزار Patchmaster ذخيره مي‌گرديد و آناليز دادهها با نرمافزار fitmaster انجام ميشد.

شکل 3-3. نمايي از وسايل ثبت داخل سلولي. ولتاژ غشاء ثبت شده توسط ميکروالکترود (A) بترتيب به آمپلي فاير، مبدل آنالوگ/ ديجيتال و ديجيتال/آنالوگ (B) و نهايتاٌ به کامپيوتر (C) منتقل مي‌شود.

3-5) مراحل آزمايش

جهت بررسي و مطالعه فعاليت خودبخودي نورون‌ها در شرايط کنترل ابتدا به مدت 5 دقيقه ثبت پايه در رينگر نرمال بعمل مي‌آمد و فرکانس و ويژگي‌هاي اسپايک‌هاي خودبخودي نورون‌ها ثبت مي‌شد. سپس بمنظور بررسي اثر مستقيم کامفر بر فعاليت الکتريکي سلول و نقش احتمالي آن در تحريک‌پذيري نوروني، اين ماده با غلظت ‌5/1 ميلي مولار به محفظه ثبت داخل سلولي افزوده مي‌شد و همانند شرايط کنترل فعاليت خودبخودي و برانگيخته مورد مطالعه قرار مي‌گرفت.
بمنظور بررسي نقش کانال‌هاي کلسيمي در رابطه با عملکردکامفر، از مهارکننده‌ اين کانال‌ نيکل کلريد (مهار کننده غير اختصاصي کانال‌هاي کلسيمي) و به منظور بررسي نقش کانالهاي سديمي ثبت در محلول فاقد سديم صورت گرفت همچنين براي بررسي نقش پروتئين کينازها از کلريترين (مهار کننده PKC )، H89 (مهار کننده PKA) استفاده شد.

3-6) پارامترهاي الکتروفيزيولوژيک مورد مطالعه

پارامترهاي الکتروفيزيولوژيک مورد بررسي در اين مطالعه از قرار زير مي‌باشند:
1. پتانسيل استراحت غشاء (RMP)
2. آستانه پتانسيل عمل (Threshold)
3. فرکانس فعاليت الکتريکي خودبخودي
4. طول مدت پتانسيل عمل در پتانسيل آستانه (Action potential duration)
5. طول مدت فاصله بين پتانسيل عملها (Interspike interval)
6. سطح زير منحني پتانسيل عمل (Integral)
7. دامنه پتانسيل عمل (AP amplitude)
8. دامنه ولتاژ پتانسيل متعاقب هيپرپلاريزان (AHP67)
9. طول مدت دوره AHP (AHP Duration)
10. شيب فاز دپلاريزاسيون و رپلاريزاسيون پتانسيل عمل (D & R slope)
11. فرکانس پتانسيل عمل در حين تزريق جريان مثبت
12. دوره مهار فعاليت متعاقب تحريک (PSIP68))
13. مقاومت ورودي سلول (input resistance)

شکل 3-4. نحوه اندازه گيري برخي پارامترهاي پتانسيل عمل

3-7) آزمون آماري

اندازهگيري پارامترهاي مورد نظر فعاليتهاي الکتريکي ثبت شده به کمک نرم افزار Fitmaster انجام شد و بمنظور مقايسه داده‌ها از آزمون آماري Repeated measure و تست تعقيبي Bonferroni يا t-test جفت شده استفاده شد. داده‌ها به صورت Mean ± SEM گزارش شده و اختلاف‌هاي با 05/0P معنيدار در نظر گرفته شدند.

فصل چهارم

نتايج

4-1) ويژگي‌هاي فعاليت خودبخودي و برانگيخته نورون‌هاي حلزون در شرايط کنترل

نورون‌هاي گانگليون تحت مري حلزون در رينگر نرمال داراي ميانگين پتانسيل استراحت mV 85/2 ± 92/41- و فعاليت ريتميک خودبخودي منظم با ميانگين فرکانس Hz 46/0 ± 13/2 بودند. ميانگين طول مدت پتانسيل عمل در آستانه پتانسيل عمل ms 04/5 ± 51/23 و متوسط فاصله بين دو پتانسيل عمل s 12/0 ± 605/0 بود. متوسط مدت فاز رپلاريزاسيونms98/3±05/19بود. دامنه و سطح زير منحني پتانسيل عمل بترتيب mV21/3±16/72 و ?Vs57/105±04/538 بود. پتانسيلهاي متعاقب هيپرپلاريزاسيون (AHP)، دامنه‌اي در حدود mV84/0 ±87/5- داشتند و متوسط طول مدت اين پتانسيل‌هاي متعاقب s028/0 ±135/0 بود. متوسط شيب فاز دپلاريزاسيون و شيب فاز رپلاريزاسيون پتانسيل عمل بترتيب mV/ms01/2±49/9 و mV/ms51/1±42/6- بود.

4-2) ويژگيهاي پتانسيل عمل خودبهخودي نورونهاي حلزون در حضور غلظت 5/1 ميلي مولار کامفر

1-2 دقيقه پس از افزودن کامفر فعاليتهاي انفجاري و PDS رخ داد (شکل 4-1) بنابراين ويژگيهاي پتانسيلهاي عمل قبل از اين واقعه مورد بررسي قرار گرفت.

شکل 4-1. الگوي فعاليت خودبخودي در شرايط کنترل، 1-2 دقيقه پس از مجاورت با کامفر و
پس از شستشوي محفظه حاوي کامفر با رينگر نرمال حلزون. افزودن کامفر بروز الگوي
burst بهمراه PDS را به دنبال داشت. اثرات کامفر بلافاصله پس از شستشوي محفظه حاوي
کامفر با رينگر حلزوني نرمال، برگشتپذير بود.

شکل4-2. مقايسه پتانسيل ثبت شده از يک نورون در زمانهاي کنترل (a)، پس از افزودن
کامفر (b) و پس از شستشو (c).دامنه و مدت AHP بدنبال افزودن کامفر کاهش يافته است. همينطور کاهش در شيب فاز پايين رو پتانسيل عمل پس از کاربرد کامفر مشاهده مي‌شود
که اثرات حاصل بعد از شستشو برگشتپذير بود.
افزودن کامفر (7n=) به محلول خارج سلولي موجب افزايش معنيدار پتانسيل استراحت غشا و آستانه شد که با 01/0P معنيداربود. فرکانس شليک پتانسيل عمل نيز با سطح معنيدار 05/0P افزايش يافت (نمودار 4-1).

نمودار 4-1. مقايسه ميانگين پتانسيل استراحت غشاء (A)، آستانه (B)، فرکانس (C) در شرايط کنترل و پس از افزودن کامفر به رينگر حلزوني نرمال (7=n). 05/P* و 01/0P** در مقايسه با

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید